Có thể áp dụng phương pháp PCR thường dùng trong phòng thí nghiệm để phát hiện virus gây bệnh herpesvirus trên cá chép hay không?

Nội dung chính

• Nguyên nhân gây nên bệnh herpesvirus là do loại virus nào gây nên?
• Có thế áp dụng phương pháp PCR thường dùng trong phòng thí nghiệm để phát hiện virus gây bệnh herpesvirus hay không?
• Thuốc thử và vật liệu thử dùng để chẩn đoán bệnh virus herpesvirus trên cá chép bằng phương pháp PCR gồm những loại nào?

Nguyên nhân gây nên bệnh herpesvirus là do loại virus nào gây nên?

Theo tiểu mục 2.1 Mục 2 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-6:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép quy định về virus gây bệnh herpesvirus như sau:

"2 Thuật ngữ và định nghĩa, các từ viết tắt

2.1 Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh do Koi Herpesvirus ở cá chép (KHV) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3). KHV (CyHV-3) thuộc giống Herpesvirus, họ Herpesviridae.

CHÚ THÍCH:

1) KHV còn có tên gọi là vi rút gây viêm thận và hoại tử mang ở cá chép (carp interstitial nephritis and gill necrosis virus - CNGV), vi rút có nhân là ADN mạch đôi.

2) Ngoài CyHV-3, herpesvirus còn có hai loại vi rút CyHV-1 và CyHV-2 cũng gây bệnh ở cá chép: CyHV-1 (vi rút đậu ở cá chép (carp pox virus) hay vi rút ung thư mụn sần ở cá (fish papilloma virus)) và CyHV-2 (vi rút gây hoại tử hệ thống tạo huyết ở cá vàng (goldfish haematopoietic necrosis). Các phân tích về di truyền đã cho thấy KHV có mối tương quan gần với CyHV-1 và CyHV-2, có liên quan xa với vi rút gây bệnh ở cá da trơn nước ngọt (lctalurid herpesvirus: lcHV-1) và herpesvirus gây bệnh ở ếch (RaHV-1). Hiện nay, có ba chủng vi rút được nghiên cứu và mô tả: KHV phân lập từ Israel, Mỹ và Nhật Bản. Kết quả giải mã di truyền gen của ba chủng vi rút này cho thấy sự tương đồng về kiểu gen rất cao (trên 99%), các chủng KHV được phân lập từ Israel và Mỹ có sự tương đồng cao hơn so với chủng vi rút được phân lập từ Nhật Bản. Ba chủng vi rút này được giải thích chúng có cùng nguồn gốc và được sinh ra từ hai nhánh (lineage): Nhật Bản và Israel - Mỹ.

...."

Nguyên nhân gây bên bệnh herpesvirus là do Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3). KHV (CyHV-3) thuộc giống Herpesvirus, họ Herpesviridae gây nên.

Ngoài CyHV-3, herpesvirus còn có hai loại vi rút CyHV-1 và CyHV-2 cũng gây bệnh ở cá chép.

Bệnh herpesvirus do loại virus nào gây nên (Hình từ internet)

Có thế áp dụng phương pháp PCR thường dùng trong phòng thí nghiệm để phát hiện virus gây bệnh herpesvirus hay không?

Theo tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-6:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép quy định về phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh herpesvirus như sau:

"6.2 Phát hiện vi rút KHV

6.2.1 Phương pháp PCR

6.2.1.1 Chiết tách ADN

Sau khi xử lý mẫu (7.1.2), tiến hành chiết tách ADN. Ví dụ sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96 1), hoặc có thể sử dụng các loại kít chiết tách tương đương, phù hợp cho chiết tách ADN vi rút (tham khảo Phụ lục B).

Sau khi chiết tách, ADN được bảo quản ở 4 °C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản âm 20 °C chờ đến khi xét nghiệm.

6.2.1.2 Tiến hành phản ứng

Các bước tiến hành phản ứng tham khảo Phụ lục C.

Phản ứng PCR phát hiện vi rút KHV sử dụng cặp mồi của Bercovier TK. Chuẩn bị các mồi ở nồng độ 20 μM với nước sạch DNAse/RNAse (4.2.3).

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng PCR theo hướng dẫn của bộ kít sử dụng. Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix HotstarTaq®Master Mix 2), Catalogue Number: 203445 của hãng Qiagen.

Thực hiện điện di sản phẩm: Sau khi khi kết thúc chương trình chạy máy PCR, lấy các ống chứa sản phẩm khuếch đại ra khỏi máy và giữ ở 4 °C để chuẩn bị cho quá trình điện di.

6.2.1.3 Đọc kết quả

- Điều kiện phản ứng được công nhận khi: Kết quả của mẫu đối chứng dương KHV có kết quả dương tính (sản phẩm khuếch đại: 409 bp). Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có sản phẩm khuếch đại).

- Đánh giá kết quả của mẫu xét nghiệm: Mẫu dương tính là mẫu được phát hiện đồng thời với đối chứng dương (có sản phẩm khuếch đại: 409 bp). Mẫu âm tính là mẫu không có sản phẩm khếch đại tương đồng với mẫu đối chứng âm."

Như vậy, khi cá chép có triệu chứng nhiệm bệnh herpesvirus thì có thể sử dụng phương pháp PCR thường dùng trong phòng thí nghiệm để phát hiện virus gây bệnh trên cá chép.

Thuốc thử và vật liệu thử dùng để chẩn đoán bệnh virus herpesvirus trên cá chép bằng phương pháp PCR gồm những loại nào?

Theo Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-6:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép quy định thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp PCR như sau:

"3. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có DNAse và RNAse, trừ khi có quy định khác.

3.1 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho lấy mẫu

3.1.1 Cồn (Ethanol), từ 70% đến 100%;

3.1.2 Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS), pH 7,2 ± 0,2 (xem Phụ lục A);

3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho PCR, realtime PCR;

3.2.1 Kít chiết tách ADN/ARN vi rút;

3.2.2 Kít nhân gen PCR, realtime PCR;

3.2.3 Nước tinh khiết, không có DNAse và RNAse.

3.2.4 Bột agarose, dung dịch TBE 10X;

3.2.5 Chất nhuộm gel (ví dụ: GelRed hoặc chất nhuộm gel tương đương);

3.2.6 Dung dịch nạp mẫu (Loading dye);

3.2.7 Thang chuẩn ADN;

3.2.8 Đoạn mồi (primers): thực hiện phản ứng PCR;

3.2.9 Đoạn mồi (primers) và đoạn dò (probe): thực hiện phản ứng realtime PCR;

3.2.10 Mẫu đối chứng: Mẫu đối chứng dương là mẫu có chứa ADN của vi rút KHV được chiết tách từ mẫu dương chuẩn. Mẫu đối chứng âm là mẫu nước không có DNAse và RNAse dùng để pha loãng các chất phản ứng."

Theo đó, khi áp dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh herpesvirus trên cá chép cần dùng những loại thuốc thử và vật liệu thử theo Tiêu chuẩn nêu trên.